HEK293 细胞中转入 S
想问下，启动子和转录因子验证的，假设存在结合作用，那么把启动子序列上的结合位点进行突变后，LUC值是不是会降低呢？
建议前体过表达，因为做microRNA的前体可以很好地模拟成熟体的一个成熟过程，如果单独的把Mir成熟体过表达，鉴于其比较短的特征在体内可出现被降解的风险，所以无特殊情况下做前体过表达更好。
FLAG一般建议放在蛋白质C端。理论上N端和C端都是可以放的，只不过蛋白质N端一般会有一些信号肽和重要的功能结构域，Flag放N端对蛋白功能影响可能会较大，所以一般不放在N端。
AAV 一般是可以维持3 个月到半年，在这个时间内理论上都有干扰/过表达效果，但是不排除特殊情况下部分AAV 一个月后可能就检测不到了，或者是到3个月的时候效果有下降，毕竟同一管病毒里面不同病毒颗粒的特性也有所差别。
可以从以下几个方面尝试提高慢病毒的感染效率：
1. 减少感染时培养基的体积；
2. 培养基中加入 5~8 μg /ml 的 Polybrene；
3. 可以适当增大MOI；
4. 延长病毒感染的时间。
RNAi 是针对转录水平的调控，到蛋白多一步翻译，某些情况下不能保证完全与蛋白水平一致：
1）该蛋白的半衰期比较长，这个需要用测定半衰期的方法检测，具体是用一些蛋白合成抑制剂处理后，隔一定时间检测该蛋白的水平；
2）该蛋白有多种转录本，可能有不同 isoform 的蛋白，要确定下是不是 siRNA是针对所有的转录本；
3）另外最后的可能就是该基因的翻译效率较高，较少 mRNA 仍能维持较高的蛋白水平。
GFP慢病毒感染细胞后，荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、
需要稀释病毒时，将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基
感染悬浮或半悬浮细胞，通常需要通过平角离心转染法提高感染效率。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，轻轻吹打混匀5-10下，室温放置
包括：包膜质粒：pMD2.G，编码VSV-G；包装质粒：编码Gag，PoI，Rev与Tat基因；目的基因质粒：含有病毒的LTRs和psi包装信号，除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件 的来激活它。第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，不能用第三代的包装系统，因为它的LTR是Tat依赖性的，而第三代删除了tat元件。
一般来说，siRNA要避免反复冻融（不能超过5次），如果只冻融了一次，对效率的影响不会很大
根据经验，这个一般200-250微升就可以
尾静脉注射BBB的血清型，其他部位也会有感染，但是表达一般比较低
蛋白质做模拟磷酸化和模拟非磷酸化的方法原理是什么？
包装AAV病毒使用的是驯化的用于包装AAV