2微升左右吧，慢病毒表达时间一般是一周，我看有很多人是4周采样的，他们应该是还想看些表型之类的。

这个启动子一般用在基因鼠上，载体上暂时还没见过文献做载体包AAV。启动子放在载体上就需要考虑序列长度以及会不会表现出内源性启动子相似的性质，要不就先构建个2000bp打几只小鼠试试。

一般要注意以下5个方面：

1、评分：在线网站预测评分较高的

2、靶点序列：避免出现连续4个及以上的T；如果用U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基是否为G或GG。

3、CG含量：一般在40%~60%之间较好。

4、靶点位置：需要设计在CDS区；要在独立外显子上，尽量靠近蛋白N段，一般是在编码区前1/3的位置；多个靶点之间序列不重叠，避免snp影响靶点有效性。

5、特异性：默认针对同源区设计，在基因组其他位置，至少出现错配3个碱基。

可以用一半的浓度压力培养。

有可能是gRNA的位置不够靠前，或者刚好敲的是3的整数倍导致后面的序列还是正常翻译，这时候可以再多设计几条gRNA试一下

miRNA在不同物种间具有保守性。是根据miRNA来划分的。但是有时候跟靶基因配对的没保守性的seed match区域也能找到一些有功能的靶点，所有有的预测网站也可以提供一些算法预测非保守区。选哪个都可以，分数高可能性越大，但是所有预测的位点都不能确定一定结合的。