可以的，慢病毒穿梭质粒理论上是可以直接在真核细胞里表达的，搭配gRNA质粒验证即可。

两种预测方法都只能作为参考，具体还是要做实验，也有targetscan预测分数很低但实验结果显示有结合的情况。然后做实验还是以targetscan给出的结合位点或者种子区为准。

一般通过在设计干扰序列对应的目的转录本的编码区CDS位置进行氨基酸同义突变即可不受干扰序列的影响，完成回补实验。

这原因很多了，转录后mRNA的剪接修饰和稳定性，或者调控因子比如miRNA的调控等等，都会影响翻译效率，从而影响蛋白的表达水平。总之，这个实验结果挺常见的。

不建议这么做，因为感染细胞的来源、状态以及病毒的生产过程对细胞感染病毒的MOI都有较大的影响。有条件的话，建议每拿到一株病毒都要做一次MOI摸索实验，以确定最好的感染效率。

融合表达后目的序列+荧光标记表达一个蛋白，荧光蛋白可以指示目的蛋白在细胞中的表达位置；非融合表达目的蛋白和荧光蛋白分开表达或表达后断裂成两个蛋白，最终是两个独立的蛋白。

两个病毒载体各加25比较好，慢病毒毒性相对来说比较大的，各加50细胞可能不太行。用25感染，如果效率低可以后期药筛。

药筛的话，悬浮细胞只能用低速离心慢慢去掉了，死细胞会随着传代换液代谢掉，如果病毒带荧光可以用流式筛选。

可以用qPCR检测，采用茎环法或者加尾法延长miRNA，然后设计对应引物就可以了。

目前用AAV9的文献比较多，之前有人改造了AAV9的衣壳蛋白，加了一段骨靶向序列(AspSerSer)6，提高了对骨器官的特异性，文献是这个https://doi.org/10.1038/s41467-019-10809-6，你可以看看。