为什么表达的荧光蛋白亮度较低？

启动子：不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，应选择广谱性或者组织特异性的强启动
子，如 EF1α、CAG 等。
表达方式（融合/非融合）：融合蛋白表达的荧光亮度通常低于单独的荧光蛋白，融合表达
时，荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱。
连接元件：在同一启动子下的非融合表达一般用 2A 肽或 IRES 将目的基因和荧光基因 ORF
分隔开。
2A 连接的是一个启动子启动的编码一条蛋白链的两个蛋白，在 2A 肽的位置会断裂。IRES 是
核糖体进入位点，允许翻译再次起始发生，两个基因分别有自己的起始密码子和终止密码子，
可以同时翻译成为两个独立的、无修饰的蛋白。
选择 IRES，下游 ORF 的表达明显弱于上游 ORF（约为上游的 10%-20%），体内实验尤为明
显。选择 2A 肽，应考虑其切割效率受上下游 ORF 序列的影响，常选择 P2A 和 T2A，P2A 切
割效率最高（某些情况高达 100％）。
序列长短：插入片段可能会影响病毒的过表达效率，转录启动效果或者翻译效率不好。但是
在实际实验的过程中我们发现，插入外源基因是会影响荧光的强度，但是和插入的片段大小
不一定是完成成正比的。
感染效率：MOI、病毒批次、细胞状态等，使用对照病毒重新摸索 MOI，或者换个细胞重新
做