293t细胞包装病毒，包装时的10%DMEM中加入1%非必须氨基酸和丙酮酸钠，包装系统是PLVX-PURO（10 μg）、PSPAX2（7.5 μg）、PMD2G（2.5 μg）。在10cm皿中，收取48h（10ml）和72h（10ml）含病毒培养液，混合后用0.22微米的滤膜过滤，分装后保存于-80℃冰箱，使用前化冻，感染时六孔板中细胞融合率大约在50%，病毒体积设置了1ml、3ml、5ml梯度，polybrene浓度为5μg/mL，感染12h后换完全培养液，但是蛋白表达程度并没有随体积而增强，因为加入5ml病毒原液的皿中有很多细胞感染后死亡，所以我感觉病毒量应该够了，想不出原因，有人知道吗？

从公司买的慢病毒，看了说明书慢病毒感染细胞不要超过24小时，实验室师兄说可感染72小时都没事，只要细胞状态可以，我感染了48小时后换成正常培养基，细胞状态差点，48小时荧光已经很强，但今天做WB和contral组比没有差别（3组不同的细胞系），是不是感染时间太长，影响蛋白的合成，还是病毒的问题？（我的是分泌蛋白，细胞中表达量高，抗体CST的一秒就爆了）

我构建了新城疫病毒几个结构蛋白的质粒，据文献报导将这几个质粒共转染细胞，细胞上清中会含有病毒粒子。我想收集细胞上清，通过蔗糖密度梯度离心得到病毒粒子用于WB。想问问大家我如果通过蔗糖密度梯度离心得到病毒粒子，我质粒需要转染几皿细胞（10毫升）才能满足收集到的病毒粒子跑WB？